電話：
021-67610176傳真：
蛋白-蛋白相互作用是蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研究中zui重要的方面之一。GST pull-down將靶蛋白與GST融合表達(dá)，并將蛋白固化在谷胱甘肽(GSH)親和樹(shù)脂上，作為與目的蛋白親和的支撐物，充當(dāng)“誘餌蛋白”，目的蛋白溶液過(guò)柱，可從中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），洗脫結(jié)合物后通過(guò)電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白。
"誘餌蛋白"和"捕獲蛋白"均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。此方法簡(jiǎn)單易行，操作方便。
GST pull-down一般指用一個(gè)帶GST tag的重組蛋白，與目的蛋白進(jìn)行孵育，zui后用結(jié)合GST的Beads拉下相互作用復(fù)合物。co-IP一般是用某一蛋白的抗體，在細(xì)胞裂解液中與相應(yīng)的蛋白結(jié)果，用Protein A/G將抗原抗體復(fù)合物拉下，zui后在拉下的復(fù)合物中檢測(cè)目的蛋白的實(shí)驗(yàn)。二者都是用于檢測(cè)蛋白相互作用的實(shí)驗(yàn)。區(qū)別是pull-down一般是驗(yàn)證in vitro相互作用；co-IP一般用于檢測(cè)細(xì)胞水平的in vivo相互作用。特殊的，也有人在重組蛋白水平，利用抗原抗體的反應(yīng)，來(lái)進(jìn)行pull-down實(shí)驗(yàn)。但這種方法文獻(xiàn)里用得很少，而且，該屬于pull-down還是co-IP，本人沒(méi)看到明確定義，個(gè)人認(rèn)為應(yīng)該屬于pull-down。
谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(Glutathione S-transferase GST)Pull-down實(shí)驗(yàn)技術(shù)是用來(lái)鑒定蛋白間相互作用的體外實(shí)驗(yàn)技術(shù)之一。該技術(shù)的原理是，首先構(gòu)建靶蛋白和GST的融合基因，導(dǎo)入細(xì)胞中表達(dá)出相應(yīng)的融合蛋白，然后提取靶蛋白-GST融合蛋白，并將其固定在谷胱甘肽親和樹(shù)脂上后充當(dāng)一種“誘餌蛋白”，將含有目的蛋白的溶液過(guò)柱，利用親和層析純化目的蛋白，從而在目的蛋白溶液中捕獲與之相互作用的“捕獲蛋白”（目的蛋白），這種結(jié)合物經(jīng)過(guò)梯度洗脫后通過(guò)SDS-PAGE電泳分析，從而證實(shí)兩種蛋白間的相互作用或篩選相應(yīng)的目的蛋白。“誘餌蛋白”和“捕獲蛋白”均可通過(guò)細(xì)胞裂解物、純化的蛋白、表達(dá)系統(tǒng)以及體外轉(zhuǎn)錄翻譯系統(tǒng)等方法獲得。
GST親和層析和GST Pull-down方法基本原理是：利用重組技術(shù)將探針蛋白與GST融合，融合蛋白通過(guò)GST與固相化在載體上的GTH(Glutathione)親和結(jié)合。因此，當(dāng)與融合蛋白有相互作用的蛋白通過(guò)層析柱時(shí)或與此固相復(fù)合物混合時(shí)就可被吸附而分離。在病毒受體研究中，融合蛋白通常設(shè)計(jì)為病毒吸附蛋白(VAP)。這方面成功的例子有HBV。具體做法如下：將GST-融合探針蛋白(VAP)和GTH-Sepharose制成親和層析柱，然后待分析的蛋白質(zhì)混合液流經(jīng)親和層析柱，梯度洗脫，分離、收集各蛋白組分，這稱為GST親和柱層析(GST affinity column chromatography)。如果一開(kāi)始待檢蛋白就和GST-融合探針蛋白與GTH-Sepharose一起共同孵育，經(jīng)離心收集洗脫復(fù)合物和洗滌后，再加入過(guò)量GTH獲得相互作用蛋白的復(fù)合物，那么這種方法則稱為GST pull down。GST親和層析及相應(yīng)的GST Pull-down方法的優(yōu)點(diǎn)是敏感，對(duì)混合物中的所有蛋白均“一視同仁”， 也可用于受體功能的鑒定。缺點(diǎn)是GST有可能影響融合蛋白的空間結(jié)構(gòu)，另外，蛋白質(zhì)濃度對(duì)實(shí)驗(yàn)也有一定影響。
酵母雙雜交技術(shù)：許多真核生物的轉(zhuǎn)錄激活因子通常具有兩個(gè)可獨(dú)立存在的結(jié)構(gòu)域，即DNA結(jié)合域(BD)與轉(zhuǎn)錄激活域(AD)。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域各具功能，互不影響。但一個(gè)完整的激活特定基因表達(dá)的激活因子必須同時(shí)含有這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。不同來(lái)源的激活因子的BD區(qū)與AD結(jié)合后則可特異地激活被BD結(jié)合的基因表達(dá)。基于這個(gè)原理，人們將兩個(gè)待測(cè)蛋白分別與這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域建成融合蛋白，并共表達(dá)于同一個(gè)酵母細(xì)胞內(nèi)。如果兩個(gè)待測(cè)蛋白間能發(fā)生相互作用就會(huì)使AD與BD形成完整的轉(zhuǎn)錄激活因子并激活相應(yīng)的報(bào)告基因表達(dá)。通過(guò)對(duì)報(bào)告基因表型的測(cè)定可以很容易地知道待測(cè)蛋白分子間是否發(fā)生了相互作用。
酵母雙雜交系統(tǒng)由三個(gè)部分組成：
②AD融合的蛋白表達(dá)載體，其表達(dá)的蛋白稱靶蛋白(prey)；
③帶有一個(gè)或多個(gè)報(bào)告基因的宿主菌株。常用的報(bào)告基因有HIS3、URA3、LacZ和ADE2等。而菌株則具有相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)缺陷型。雙雜交質(zhì)粒上分別帶有不同的抗性基因和營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記基因，有利于雜交質(zhì)粒的鑒定與分離。根據(jù)目前通用系統(tǒng)中BD來(lái)源主要分為GAL4系統(tǒng)和LexA系統(tǒng)。后者因BD來(lái)源于原核生物，在真核生物內(nèi)缺少同源性，因此可以減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)。近年來(lái)，開(kāi)始出現(xiàn)了應(yīng)用酵母雙雜交技術(shù)進(jìn)行病毒受體研究的成功報(bào)告，如麻疹病毒的絨猴細(xì)胞受體。李凌云等構(gòu)建了表達(dá)“獵物”(prey)蛋白的質(zhì)粒和表達(dá)病毒VAP“誘餌”(bait)蛋白的質(zhì)粒，然后共轉(zhuǎn)染同一酵母細(xì)胞，利用已建立的易感細(xì)胞cDNA文庫(kù)，篩到了陽(yáng)性克隆。酵母雙雜交技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，特異性較好，缺點(diǎn)是容易出現(xiàn)假陽(yáng)性和假陰性，而且對(duì)蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的定位有要求。為了克服上述缺點(diǎn)，人們進(jìn)一步優(yōu)化出所謂“雙篩選系統(tǒng)”，即蛋白質(zhì)相互作用必須同時(shí)激活兩個(gè)以上報(bào)道基因，具有兩種以上的相應(yīng)表型才算是真的陽(yáng)性結(jié)果。另外，人們也改造了酵母雙雜交系統(tǒng)所用的載體系統(tǒng)，將在細(xì)胞漿內(nèi)發(fā)生的蛋白質(zhì)相互作用轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜上進(jìn)行，以此來(lái)更容易地篩選膜蛋白受體，如Ras recruitment system(RRS)。
GST-pulldown操作流程 材料及試劑
探針蛋白與GST融合的原核蛋白，裂解的細(xì)胞蛋白，或者組織蛋白提取物 細(xì)胞蛋白裂解液，
洗脫液： PBS及PBS+1%Triton-100
PBS (1L)
NaCl： 8g
KCl： 0.2g
Na2HPO4： 1.44g
KH2PO4： 0.24g
加入800ml蒸餾水，用HCl調(diào)節(jié)溶液的pH值至7.4，zui后加蒸餾水定容至1L即可，高溫高壓滅菌！4℃保存?zhèn)溆茫?nbsp;
PMSF MW:174.19 工作濃度0.1-1mM，這里使用1mM，儲(chǔ)存濃度100mM，將0.174g PMSF溶于10ml無(wú)水乙醇混勻即可！保持于-20℃或者4℃
（以下流程僅供研究已知原核蛋白A和真核過(guò)表達(dá)蛋白B相互作用）
1 · 原核融合蛋白A的獲得
1.1 將編碼蛋白A與GST的重組質(zhì)?；D(zhuǎn)BL21(DE3)菌株
1.2 挑取單個(gè)克隆到含有5mlLB(+100ug/mlAmp)的10ml試管里，37℃培養(yǎng)過(guò)夜
1.3 將培養(yǎng)菌液轉(zhuǎn)移到含有500ml LB(+100ug/mlAmp)的1L錐形瓶中，37℃，225rpm培養(yǎng)至OD600≈1.0-1.5左右，加入適當(dāng)濃度的IPTG，在適當(dāng)溫度下培養(yǎng)適當(dāng)時(shí)間（誘導(dǎo)條件需要根據(jù)不同的蛋白做調(diào)整），6000g，10分鐘，4℃離心收集細(xì)菌，去盡上清，將菌體至于-20℃放置O/N
1.4 室溫凍融菌體，馬上置于冰上，每500ml培養(yǎng)液加入10-20ml細(xì)菌裂解液(BS+1%Triton-100+PMSF)吹打混勻
1.5 冰上超聲破碎，開(kāi)2秒，停9秒，總40-60分鐘。至裂解液充分清涼 1.6 11000rpm，15分鐘，4℃離心分離上清，-80℃保存?zhèn)溆?nbsp;
2 真核融合蛋白B的獲得
2.1 將編碼B蛋白的堿基序列克隆到編碼標(biāo)簽蛋白（如HA,或者myc）的真核表達(dá)載體上，進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染 xq
3 · 48小時(shí)后，取適量融合蛋白GST-A于冰上凍融
4 · 取50-70ulGST-Beads(Immobilized Glutathione)到EP管中，用800ul PBS+1%Triton-100潤(rùn)洗一次，將凍融融合蛋白GST-A與之混勻，4℃層析柜旋轉(zhuǎn)結(jié)合1小時(shí)。
5 · PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。留取20ul(PBS+Beads)作Offer。
6 · 同時(shí)，裂解真核融合蛋白B，去盡培養(yǎng)基，用PBS(RT)洗一次，加入300ul裂解液（以6well為例，PBS+1%Triton-100+ Cocktaier），4℃放置30分鐘。
7 · 吹打收集至1.5mlEP管，超聲破碎。13000rpm，15分鐘，4℃離心取上清。
8 · BCA蛋白定量(optional)留取20ul做Offer，其余樣品加入到已純化蛋白的EP管中，用PBS補(bǔ)足液體到600ul左右，以便蛋白之間能充分結(jié)合！4℃旋轉(zhuǎn)結(jié)合O/N。
9· PBS+1%Triton-100洗3次，PBS洗3次。
10· 40ul 5×loading buffer溶解beads上的蛋白，煮沸3分鐘，高速離心，Run -SDS PAGE做Western Blot檢測(cè)。用HA或者myc Blot。
13224517959
