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Part I：天然抗體庫(kù)構(gòu)建、免疫抗體庫(kù)構(gòu)建、多種片段抗體庫(kù)構(gòu)建、抗體人源化
1、技術(shù)路線
外周血淋巴細(xì)胞/脾細(xì)胞?提取RNA/gDNA?PCR出全套抗體片段（Fab、scFv等）?隨機(jī)重組插入噬菌體外殼蛋白?感染大腸桿菌?抗體片段展示于噬菌體表面?抗原特異性篩選?富集有效結(jié)合克隆?擴(kuò)增結(jié)合力強(qiáng)的克隆。
2、技術(shù)應(yīng)用（主要在醫(yī)學(xué)口）
（1）在寄生蟲(chóng)醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用（如瘧原蟲(chóng)、吸血蟲(chóng)等），進(jìn)行診斷試劑與疫苗的開(kāi)發(fā)，例如分子疫苗制備、保護(hù)性抗原制備。
篩選抗靶蛋白抗體可變區(qū)---研究蛋白分子免疫識(shí)別---篩選診斷試劑/篩選新型疫苗 例子：篩選抗寄生蟲(chóng)抗原的鼠源抗體scFv可變區(qū)片段，進(jìn)一步研究抗原結(jié)構(gòu)和功能，后續(xù)可以制備治療用和診斷用的抗體。
優(yōu)勢(shì)：人源化的抗體/抗體片段可通過(guò)工程菌進(jìn)行大量生產(chǎn)，降低成本。
（2）在醫(yī)學(xué)微生物中的應(yīng)用（已獲得針對(duì)HAV、HBV、HCV、HIV、VZV、RSV、風(fēng)疹病毒、CMV、流感嗜血桿菌和破傷風(fēng)毒素、呼吸道合胞病毒、單純皰疹病毒糖蛋白、TNF-alpha等的單抗） 作為診斷試劑、治療藥物的開(kāi)發(fā)工具。
成功案例：對(duì)病毒性肝炎診治，對(duì)肝炎臨床診斷、基因治療、發(fā)病機(jī)制研究研究提供工具 （3）細(xì)胞內(nèi)免疫：針對(duì)病毒或腫瘤抗原表達(dá)
例子：將篩庫(kù)得到的高親和力抗體的scFv基因?qū)氩溉閯?dòng)物細(xì)胞，通過(guò)表達(dá)的抗體與靶抗原結(jié)合阻止病毒生成、干擾腫瘤細(xì)胞的代謝。 （4）血液心血管系統(tǒng)研究
例子：血栓類(lèi)心血管疾病研究：血栓形成導(dǎo)致多種心血管疾病，使用噬菌體篩庫(kù)得到的抗人纖維蛋白單鏈抗體可用于血栓性疾病的定位診斷、導(dǎo)向性溶栓治療。優(yōu)勢(shì)：?jiǎn)捂溈贵w分子量小（抗體的zui小活性單位）、組織穿透力強(qiáng)、體內(nèi)清除快、集中針對(duì)目標(biāo)組織。 例子1：血液類(lèi)：EPO為治療貧血多肽藥物，篩庫(kù)得抗EPO單鏈抗體，用于獲得重組buEPO及研發(fā)EPO檢測(cè)試劑盒。
例子2：血液類(lèi)：構(gòu)建50AMcAb單鏈?zhǔn)删w抗體庫(kù)，研發(fā)原核表達(dá)的血型鑒定抗體試劑；構(gòu)建抗人紅細(xì)胞單鏈抗體scFv，與ABO血型無(wú)關(guān)，用于快速血凝診斷 （5）自身免疫疾病研究（重癥肌無(wú)力、Grave’s病、喬本氏甲狀腺炎等） 研究人體自身抗體1
的分布、基因構(gòu)建、遺傳規(guī)律、產(chǎn)生機(jī)制及自身抗原2的性質(zhì)
自身抗體是指針對(duì)自身組織，器官、細(xì)胞及細(xì)胞成分的抗體。正常人體血液中可以有低滴度的自身抗體，如果自身抗體的滴度超過(guò)某一水平，就可能對(duì)身體產(chǎn)生損傷，誘發(fā)疾病。優(yōu)勢(shì)：容易操作，可大量制備，抗體人源化。已發(fā)現(xiàn)的64株IgG類(lèi)自身抗體中有49株是噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)得到的
其他自身免疫疾病研究：干燥綜合征、重癥肌無(wú)力、原發(fā)性膽汁硬化癥、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、魏格納氏肉芽腫
（6）腫瘤研究及藥物靶向治療
利用腫瘤相關(guān)抗原TAA或腫瘤特異性抗原TSA從噬菌體抗體庫(kù)中篩選，得到的單鏈可變區(qū)抗體分子量小，組織滲透性強(qiáng)，可用于體內(nèi)造影診斷、免疫治療抗體藥物開(kāi)發(fā)。 優(yōu)勢(shì)：噬菌體抗體庫(kù)篩選的TAA TSA抗體具有親和力強(qiáng)、特異性高的特點(diǎn)，可用于靶向治療 例子：從HBx（肝癌相關(guān)抗原）單抗細(xì)胞中克隆重鏈可變區(qū)基因，重組入M13噬菌體，驗(yàn)證表達(dá)產(chǎn)物具有活性，然后表達(dá)出單鏈抗體、單域抗體或嵌合抗體，為肝癌導(dǎo)向治療研究提供基礎(chǔ)。
（7）弱免疫原性物質(zhì)的特異性抗體制備：
制備一些很難獲得的抗體，如特異性識(shí)別MHC I類(lèi)分子-抗原肽復(fù)合物的抗體、胸腺上皮抗體、雌激素抗體等。 （8）食品安全、環(huán)境安全檢測(cè)
例子1：以致癌物質(zhì)黃曲霉素偶聯(lián)物免疫小鼠，制備小鼠源性抗黃曲霉素單鏈抗體ScFV庫(kù)，篩選高親和力抗體，可用于對(duì)花生等進(jìn)行食品安全檢測(cè)
例子2：以除蟲(chóng)菊酯偶聯(lián)物免疫小鼠，構(gòu)建噬菌體抗體文庫(kù)并篩選抗除蟲(chóng)菊酯的高親和力抗體，對(duì)監(jiān)測(cè)環(huán)境中農(nóng)藥殘留、提高種植業(yè)科學(xué)用藥具有重要意義 總結(jié)：
噬菌體抗體庫(kù)構(gòu)建這塊，大多應(yīng)用于醫(yī)學(xué)相關(guān)研究，客戶(hù)主要集中于醫(yī)院中設(shè)立的研發(fā)機(jī)構(gòu)，且大多涉及到人源化改造，其次也有些科研用戶(hù)，比如高校或研究所的醫(yī)學(xué)生物相關(guān)專(zhuān)業(yè)，研究與疫病、自身免疫等相關(guān)科室，會(huì)用到動(dòng)物自身抗體來(lái)做研發(fā)，另外還有一類(lèi)，也是目前我們準(zhǔn)備研發(fā)的項(xiàng)目，前景較大，跟組學(xué)相關(guān)聯(lián)，客戶(hù)在組學(xué)這塊做完差異蛋白鑒定之后，在眾多差異蛋白中無(wú)法確定優(yōu)先做哪些蛋白，但是又想進(jìn)一步研究蛋白表達(dá)差異時(shí)，需要制備較多抗體，可借用我們構(gòu)建的鼠抗體庫(kù)或者兔抗體庫(kù)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模蛋白的抗體篩選，可zui大程度的降低成本和周期。
Part 2： 噬菌體隨機(jī)多肽庫(kù)
1、技術(shù)路線
多肽序列設(shè)計(jì)? DNA序列?插入噬菌體外殼蛋白?感染大腸桿菌?抗體片段展示于噬菌體表面?抗原特異性篩選?富集有效結(jié)合克隆?擴(kuò)增結(jié)合力強(qiáng)的克隆。
2、技術(shù)應(yīng)用
（1）蛋白相互作用
能誘導(dǎo)宿主發(fā)生自身應(yīng)答的物質(zhì)稱(chēng)為自身抗原。正常情況下免疫系統(tǒng)對(duì)自身物質(zhì)不作為抗原來(lái)對(duì)待，但當(dāng)機(jī)體受到外傷或感染等刺激時(shí)，就會(huì)使隱蔽的自身抗原暴露或改變自身的抗原結(jié)構(gòu)，或者免疫系統(tǒng)本身發(fā)生異常，這些情況均可使免疫系統(tǒng)將自身物質(zhì)當(dāng)作抗原性異物來(lái)識(shí)別，誘發(fā)自身免疫應(yīng)答，引起自身免疫病。
研究互作蛋白間氨基酸殘基的特征，為蛋白質(zhì)相互作用和功能基因組學(xué)的研究提供工具。例如對(duì)功能蛋白的“熱點(diǎn)”-蛋白互作的zui小功能域-進(jìn)行鑒定，鑒定重要生物大分子如生長(zhǎng)激素受體、胰島素受體、胰島素樣生長(zhǎng)因子受體、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）受體的激動(dòng)劑和拮抗劑，這類(lèi)多肽定義為熱點(diǎn)配體HSPL。
例子1：Pillulta用高度多樣性的隨機(jī)肽庫(kù)噬菌體文庫(kù)進(jìn)行篩選，分離出10個(gè)能競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合胰島素受體的多肽，并且與胰島素?zé)o序列同源性，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)鑒定實(shí)驗(yàn)確定了這些多肽在胰島素分子上的結(jié)合位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)激活的酶活性類(lèi)型和激動(dòng)劑、拮抗劑功效。
例子2：TNF-α和TNF-β具有防御感染的左右，其生物學(xué)效應(yīng)由膜受體TNFR1(p55)和TNFR2(p75)來(lái)介導(dǎo)，用TNFR2(p75)篩選肽庫(kù)分離到了4個(gè)與TNFR2特異性結(jié)合HSPL肽，其中有3個(gè)能誘導(dǎo)靶細(xì)胞的細(xì)胞毒反應(yīng)。
（2）腫瘤相關(guān)抗原研究
鑒定分析腫瘤細(xì)胞或腫瘤血管內(nèi)皮表達(dá)的特異性癌細(xì)胞抗原的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)腫瘤的早期診斷和靶向治療有重要意義。例如篩選腫瘤相關(guān)抗原、尋找具有治療作用的靶肽等。 例子1：用胃癌單抗MG7-Ab對(duì)隨機(jī)肽庫(kù)進(jìn)行篩選，得到相對(duì)保守的表位信息，為研究單抗與胃癌相關(guān)抗原MG7-Ag的結(jié)合的結(jié)構(gòu)奠定基礎(chǔ)
例子2：抗腫瘤單抗分子量大，組織滲透力差且易被肝、單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)非特異性吸收，肽類(lèi)藥物可以克服這些缺點(diǎn)。用人B細(xì)胞淋巴癌細(xì)胞系SUP-88表面*性進(jìn)行篩庫(kù)，得到一系列現(xiàn)行肽基元，其中一些短肽以二聚體或四聚體形式呈遞給完整細(xì)胞時(shí)能激發(fā)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。
例子3：用前列腺癌特意性抗原PSA篩選肽庫(kù)鑒定到的配體肽與PSA的結(jié)合受鋅離子影響，有發(fā)展為治療制劑的潛力。
（3）疫苗研制
噬菌體肽庫(kù)能篩選到一些抗原的模擬表位，這些模擬抗原還具有一定的免疫原性，能刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，產(chǎn)生的抗體能與真正的病原體上的天然表位反應(yīng)，這有利于將發(fā)現(xiàn)的表位作為人工合成疫苗的一個(gè)組分，在疫苗設(shè)計(jì)方面有廣泛的應(yīng)用前景。
例子：為解決非典型嗜血流感桿菌毒力因子表面蛋白混合寡糖LOS制備疫苗遇到的免疫原型弱的問(wèn)題，用兔抗LOS篩選肽庫(kù)，得到4個(gè)一致性序列，其中3個(gè)與兔抗親和力高。用篩選得到的3個(gè)高親和力肽免疫兔得到的抗體對(duì)染病小鼠模型具有抗體保護(hù)性作用。 總結(jié)：
噬菌體隨機(jī)肽庫(kù)，zui主要的應(yīng)用，就是研究互作，不管是天然組織、細(xì)胞或者蛋白，還是重組的蛋白及合成的多肽，想了解與其互作的克隆序列，進(jìn)而結(jié)合物種內(nèi)蛋白序列進(jìn)行分析，確認(rèn)可能互作的蛋白信息，其次就是獲取抗原表位序列，抗原決定簇一般由5-12個(gè)aa組成，通過(guò)抗體對(duì)多肽庫(kù)的篩選，獲得對(duì)應(yīng)表位的序列，為疫苗研發(fā)等工作提供依據(jù)
Part 3雙特異性抗體BsAb
1、技術(shù)應(yīng)用
（1）導(dǎo)向免疫治療
雙特異性抗體主要應(yīng)用于腫瘤的治療中，它一方面能夠結(jié)合免疫效應(yīng)細(xì)胞表面的激活分子（能激活效應(yīng)細(xì)胞如T細(xì)胞、NK細(xì)胞）或偶聯(lián)毒素，另一方面結(jié)合腫瘤相關(guān)抗原TAA，從而發(fā)揮對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。
例子1：用長(zhǎng)春花堿的BsAb注射入荷瘤小鼠，腫瘤的生長(zhǎng)受到明顯抑制
例子2：在體外實(shí)驗(yàn)中，用抗CD3-抗HIV的BsAb武裝的T淋巴細(xì)胞能對(duì)HIV感染的靶細(xì)胞產(chǎn)生顯著的細(xì)胞毒效應(yīng)，且不受HIV的制約，所以健康人的T細(xì)胞有望用于HIV患者的治療。 例子3：用抗CD3-抗腫瘤的BsAb與淋巴因子激活的殺傷LAK細(xì)胞結(jié)合起來(lái)治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者，兩年存活率相比于只是用LAK細(xì)胞的一組明顯升高。
（2）免疫學(xué)診斷
抗靶抗原-抗標(biāo)記酶的BsAb能用一步法簡(jiǎn)化檢測(cè)流程，在免疫檢測(cè)方面有優(yōu)勢(shì)
例子1：免疫組織學(xué)標(biāo)記過(guò)程中，使用BsAb與標(biāo)記酶分步加樣，因?yàn)锽sAb分子量小，組織穿透力強(qiáng)，故能提高檢測(cè)靈敏度
例子2：魏巍制備的針對(duì)人膀胱移行細(xì)胞癌的BsAb具有良好特異性，對(duì)正常膀胱粘膜組織和腺癌組織切片均未顯色。
例子3：抗HCG和抗脲酶的BsAb在夾心ELISA中HCGzui低檢出限為25U/L，與相應(yīng)的酶抗體檢測(cè)結(jié)果相當(dāng)，此抗體與酶結(jié)合物在4 ℃穩(wěn)定性達(dá)數(shù)月之久。將抗體與某些酶基因相連，表達(dá)出的酶標(biāo)抗體可直接用于檢測(cè)和示蹤研究
在影像學(xué)診斷方面，BsAb能有效提高放射性標(biāo)記物對(duì)病變部位的趨向性，減少對(duì)正常組織的損害。
例子4：用放射性碘標(biāo)記的抗CEA片段分別與單價(jià)scFv、scFv二聚體、scFv-CH3微型抗體結(jié)合，對(duì)LS174T荷瘤無(wú)胸腺小鼠進(jìn)行腫瘤靶向和生物分布研究，scFv-CH3微型抗體的藥代動(dòng)力學(xué)和清除特性適中，適合定位顯影。
例子5：將CEA/HSG BsAb聯(lián)合PET和SPECT應(yīng)用于肺內(nèi)微轉(zhuǎn)移的人結(jié)腸癌裸鼠分子顯影中，該CEA/HSG BsAb具有高度靶向定位特性。
（3）免疫性疾病治療中的應(yīng)用 過(guò)敏性疾病中的應(yīng)用：
例子1：Tam發(fā)現(xiàn)IgE/Fcy II BsAb不會(huì)引發(fā)IgE致敏細(xì)胞中組胺的釋放，它能阻止引發(fā)組胺釋放的特定抗原的觸發(fā)，同時(shí)抑制肥大細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞的活化，能應(yīng)用于過(guò)敏性疾病的治療。
例子2：Lum發(fā)現(xiàn)CD3/CMV BsAb能夠靶向T細(xì)胞，可以用來(lái)預(yù)防和治療造血干細(xì)胞移植后的巨細(xì)胞病毒感染。
總結(jié)：
雙特異性抗體，主要應(yīng)用方向也是在靶向治療上面，雙特異性，顧名思義有2個(gè)抗體靶向，一個(gè)用于定位，一個(gè)用于消除，真正做診斷靶向級(jí)別的客戶(hù)，一般不會(huì)選擇定制，如果只是研發(fā)方向，為寫(xiě)文章，這個(gè)都是可以做的，所以客戶(hù)群體相對(duì)分散，有意向咨詢(xún)可再做詳細(xì)跟進(jìn)。
Part 4 參考文獻(xiàn)
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