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1、簡介
重疊PCR也是基本的PCR原理:變性-退火-延伸。不同的是在重疊PCR過程是兩個或者幾個片段重疊延伸之后,再進行指數擴增的PCR過程。
2、基本原理
*步:PCR產生兩個或者幾個片段,這幾個片段之間必須有重疊區。
第二步:以兩個片段為例,見上圖,*步產生的兩個片段,A D鏈之間有互補,B C鏈之間也有互補,但只有A D鏈互補重疊延伸產生所需要的重疊片段。
第三步:第二步產生的重疊產物,在上下游引物的存在下,即可進行PCR擴增過程。 請仔細看清楚原理,特別是第二步。
3.實際操作注意點
a.*步PCR之后的產物,可以純化,也可以吸取幾μL作為重疊PCR的模板。
b.第二步和第三步一起稱為重疊PCR,實際發生過程分為兩個步驟。
c.Taq酶會在末端加A,高保真酶有3’— 5’的外切活性,基于重疊PCR原理和酶的性質,*步和重疊PCR步驟至少有一步使用高保真酶(或者如Taq Plus、EsTaq之類的,有3’— 5’的外切活性),如果*步和重疊PCR都使用普通Taq可能重疊PCR會失敗。
d.基于重疊PCR原理,上圖中第二步A D 鏈直接的退火很關鍵,所以有些protocol會建議重疊PCR分兩個程序進行也是基于以上原理。重疊區的Tm很關鍵,或者說退火溫度很重要。
4.重疊PCR幾個應用場景
.片段中間引入突變
b.片段中間引入缺失
C.片段中間引入插入片段
d.片段拼接(如不同結構域DNA pian段拼接)
e.長片段分段擴增,再重疊PCR拼接
f.從基因組擴增出外顯子,再拼接出完整的CDS區