| 實(shí)驗(yàn)步驟 | 一、材料
1. 緩沖液、溶液和試劑
溴化乙錠
Taq 延伸 PCR 添加劑（Stratagene)
Tween20，10% 溶液
2. 酶和酶緩沖液
dNTP 溶液（包含所有的 4 種 dNTP，每種都是 25 mmol/L)
PCR 緩沖液，10X, 用戶買熱穩(wěn)定聚合酶時(shí)公司一并提供，或者 PCR 優(yōu)化緩沖液，比如，Opti-Prime PCR 優(yōu)化試劑盒（Stratagene)，以及 PCR Optimizer(Invitrogen)
熱穩(wěn)定 DNA 聚合酶（5~10U)，比如，Taq DNA 聚合酶，克隆化的 Pfu DNA 聚合酶(Stratagene)
3. 核酸和寡核苷酸
可選擇：插入物特異的引物（在雙向克隆中用來確定插入物的方向）
一套篩選重組體的引物
4. 設(shè)備
用于劃板和接菌的無菌槍頭
用槍頭代替牙簽，是因?yàn)檠篮灴赏ㄟ^毛細(xì)作用帶走液體，因此會(huì)改變反應(yīng)混合物的濃度。
5. 額外項(xiàng)目
瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備和試劑，包括溴化乙錠
二、方法
1. 根據(jù)反應(yīng)數(shù)目或要做的 PCR 反應(yīng)的管數(shù)，在冰上用一個(gè)離心管像調(diào)雞尾酒一樣準(zhǔn)備
PCR「雞尾酒」式混合物，按如下順序依次加入各種成分。
H2O 將終體積補(bǔ)充到 25ul
Taq 緩沖液，10X 2.5ul
Tween20(體積分?jǐn)?shù) 10% 溶液） 1.0ul
dNTP 混合物（每種 dNTP 為 25 mmol/L) 0.2ul
重組體篩選引物套（100ng/ul) 1ul
Taq 延伸 PCR 添加劑（5U/ul) 0.25ul
Taq DNA 聚合酶（5U/ul) 0.25ul
2. 在冰上，分裝"雞尾酒"式 PCR 混合物到每一個(gè) PCR 試管中，每管移取 25ul。
3. 對(duì)照反應(yīng)中，加入 1ul 的非重組 DNA。
可以選擇：對(duì)于用來確定插入方向的反應(yīng)，向恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)管中加入第三個(gè)插入物特異的引物。
4. 對(duì)于重組篩選，用一個(gè)無菌槍頭刺挑一下轉(zhuǎn)化后長(zhǎng)出的菌落，然后在相應(yīng)的反應(yīng)管中攪動(dòng)菌落物質(zhì)。在給每一個(gè)反應(yīng)混合物接種后，迅速地移走槍頭，并在含有抗生素平板上輕涂以留菌種，以備后續(xù)分析。對(duì)于 PCR 介導(dǎo)的重組篩選，也可參考下面的疑難解答。
5. 輕輕混勻每個(gè)反應(yīng)體系。
6. 用推薦的循環(huán)參數(shù)進(jìn)行 PCR。
7. 用標(biāo)準(zhǔn)的瓊脂糖凝膠電泳分析 PCR 產(chǎn)物。推薦用 10~15 g/L 瓊脂糖凝膠來優(yōu)化分辨500~6000bp 的 PCR 產(chǎn)物。通常，取 1~5ul PCR 產(chǎn)物經(jīng)溴化乙錠染色后分析。可以通過傳統(tǒng)的瞬間成像技術(shù)或計(jì)算機(jī)圖像軟件來獲取圖像。 |
|---|
